用户文章Gut：单细胞+m6A揭示YTHDF1增强抗肿瘤免疫 | m6A专题&单细胞专题
文献名称：靶向m6A reader YTHDF1可增强抗肿瘤免疫，提高抗pd-1对结直肠癌的疗效
期刊：GUT
发表时间：2023
测序组学：scRNA-seq、m6A-seq
影响因子：24.5
m6A修饰通过调节RNA的剪接、翻译和降解，在癌症中发挥重要作用，但是m6A甲基化修饰在肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用仍未得到充分研究。本篇研究作者阐述了YTHDF1在结直肠癌（CRC）中的功能和机制。
首先作者在公共数据库TCGA，对m6A转录因子进行拷贝数和基因表达分析发现，YTHDF1在近80%的结直肠癌肿瘤中表现出拷贝数增益或扩增，且在m6A调控因子中属于top级别。为了建立抗肿瘤免疫和m6A调控因子之间的联系，作者采用GSEA方法分析了m6A调控因子与IFN-γ应答基因特征之间的相关性。作者发现YTHDF1与IFN-γ反应通路呈显著的负相关（q<0.0001）。
值得注意的是，IFN-γ反应与诱导抗肿瘤免疫和对ICB治疗的反应性有关。接下来的基因相关性和免疫组化分析结果也均显示YTHDF1的表达与18个与IFN-γ相关基因签名强烈负相关（图1A），这种现象预示着在多种癌症类型中对抗PDL1的反应性。
此外，CD8A或CD8+ T细胞特征16的表达与YTHDF1的表达呈负相关。与TCGA数据一致，TMA的IHC染色显示，I队列中YTHDF1的高蛋白表达与CD8+ T细胞的低浸润相关（p<0.001，r=−0.248，n=206）（图1B)和队列II（p<0.0001，r=−0.269，n=202）（图1C）。这些数据揭示了m6A阅读器YTHDF1与抗肿瘤免疫功能受损和ICB治疗疗效降低相关。
图 1
为了研究YTHDF1在调节抗肿瘤免疫中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系统敲除MC38小鼠MSI-HCRC细胞中的Ythdf1（Ythdf1-KO），并将细胞注射到同基因中cC57BL6小鼠（图1D）。
作者发现，与对照组（NC）相比，敲除Ythdf1都降低了肿瘤的体积和重量（图1E）。为了询问Ythdf1-KO是否影响发育，作者从肿瘤中分离出CD45+免疫细胞，并进行了单细胞RNA-seq（scRNA-seq）（NC:1480个细胞；Ythdf1-KO:1816个细胞）。与NC组相比，Ythdf1-KO肿瘤表现出粒细胞髓系来源的抑制细胞（G-MDSCs，簇3）和中性粒细胞明显减少(图1F)。相比之下，在Ythdf1-KO肿瘤中，T细胞和NK细胞显著增加（图1F）。
作者进一步将T细胞和NK细胞重新聚集到CD4+ T、CD8+ T、NKT和NK中 与对照组相比，在Ythdf1-KO肿瘤中，这些细胞亚群同时增加（图1F）。因此，作者推测YTHDF1可以通过诱导MDSC的积累来抑制其抗肿瘤免疫。作者检测了MDSCs、Il1b、Arg2、Cxcr2和Ccr2的功能标记物，这些基因主要富集于MDSC簇（簇3和簇4）中，特别是在Ythdf1未敲除的肿瘤中（图1G)。因此，来自这个同基因模型的数据支持YTHDF1在结直肠癌中的免疫抑制功能
为了验证作者在scRNA-seq分析中的发现，作者通过流式细胞术测定了MC38同基因小鼠中肿瘤浸润性免疫细胞的组成。作者证实了Ythdf1基因敲除显著抑制了肿瘤的重量和体积。（图1C），流式细胞术显示，Ythdf1敲除降低了肿瘤中的MDSCs，但增加了肿瘤中的CD8+ T和CD4+ T细胞（图1H，I）。在MDSCs中，G-MDSCs是主要的亚群，敲除Ythdf1导致G-MDSCs显著减少（图1I）。根据MDSCs的免疫抑制功能，作者观察到了信号 Ythdf1-KO组的功能性T细胞明显增加，包括IFN-γ+ CD8+ T细胞、颗粒酶B+ CD8+ T细胞和IFN-γ+ CD4+ T细胞（图1H，J）。
接下来，作者用Ythdf1-KO在CT26（MSS-CRC）中进行实验，以验证YTHDF1在调节抗肿瘤免疫中的作用。与预期的一样，Ythdf1-KO导致CT26同基因小鼠中的肿瘤体积和重量减少( 图2A，B)，以及功能T细胞的减少和MDSCs的积累（图2C，D）。免疫荧光染色证实，在Ythdf1敲除后，MC38和CT26同基因肿瘤中MDSCs（CD11b+Gr-1+）的浸润减少（图2E）。总的来说，CRC细胞中Ythdf1的缺失减少了MDSCs，增加了功能性T细胞的浸润。这些发现与YTHDF1与CD8+ T和IFN-γ细胞相关的临床数据一致(图1A-C）。
作者询问Ythdf1-KO中减弱的肿瘤形成是否依赖于CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫。为了解决这个问题，作者用MC38同基因中的抗CD8抗体来耗尽CD8+ T细胞模型。与作者的假设一致，CD8+ T细胞的消耗恢复了Ythdf1-KO肿瘤的生长（图2F，G），这表明Ythdf1-KO的肿瘤抑制功能至少部分依赖于CD8+ T细胞。这在CT26同基因小鼠中得到了证实，表明抗cd8抗体治疗挽救了Ythdf1-KO组受阻的肿瘤生长（图2H，I）。通过流式细胞术证实了用抗CD8抗体去除CD8+ T细胞。总之，Ythdf1基因敲除通过诱导CD8+ T细胞依赖性的抗肿瘤免疫来抑制CRC的生长。
图 2
为了验证YTHDF1在自发性结直肠肿瘤发生中的作用，作者生成了肠特异性YTHDF1敲除小鼠（Ythdf1loxp/loxpCDX2-cre），并通过AOM/DSS trea在这些小鼠中启动结直肠癌（图3A)。作者发现，在AOM/DSS模型中，Ythdf1的过表达导致了结肠肿瘤的数量和大小的增加（图3C）。作者发现，在AOM/DSS模型中，Ythdf1的过表达导致了结肠肿瘤的数量和大小的增加（图3C）。此外，作者发现Ythdf1的敲除降低了颗粒酶B、INF-γ和TNF-α表达所鉴定的功能性T细胞的比例（图3E）。
接下来，作者试图通过建立ApcMin/+Ythdf1loxp/ loxpCDX2-cre小鼠，在ApcMin/+驱动的自发性结直肠癌中（图3B）中验证这些结果。一致地，Ythdf1基因的肠道特异性敲除的ApcMin/+小鼠产生了明显更大的结肠肿瘤（图3C）。数据分析显示Ythdf1的敲除，显著减少了ApcMin/+肿瘤中NK、CD4+ T和CD8+ T细胞的浸润，并诱导了MDSCs（图3F）。此外，Ythdf1敲除重复 ApcMin/+小鼠中的Ed颗粒酶B+、INF-γ+或TNF-α+ T细胞（图3G）。综上所述，这些结果支持了YTHDF1促进了一种促进自发性结直肠癌的免疫抑制微环境。
图 3
为了确认YTHDF1在调节人类抗肿瘤免疫应答中的作用，作者建立了CD34+人源化小鼠模型。作者使用含有>20%人类CD45+细胞的外周血单个核细胞（PBMCs）的小鼠进行实验。为了在体内针对YTHDF1进行靶向治疗，作者开发了携带针对YTHDF1的siRNA的VNPs（核酸纳米粒子）。
作者使用携带siNC（负向对照）或siYTHDF1的VNPs治疗携带人类结直肠癌HCT116异种移植物的人源化NSG小鼠，在肿瘤达到50-100mm3后进行治疗（图4B）。与VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF1显著抑制了肿瘤的体积和重量（图4B，C）。
作者还进行了流式细胞术来分析TIME（图4D）。VNP-siYTHDF1降低了MDSC 过滤，但增加了CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的积累（图4E）。此外，在接受VNP-siYTHDF1治疗的肿瘤中发现了更多的IFN-γ+、TNF-α+和颗粒酶B+ CD8+ T细胞（图4E）。
作者还通过测定肝脏血清标志物（丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶）和肾功能（肌酐和血尿素氮）的血清标志物来确定VNP-siYTHDF1的安全性。用VNP-siNC或VNPsiYTHDF1治疗的小鼠没有表现出异常的肝肾功能指标，表明VNP治疗的耐受性良好。因此，利用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是一种安全有效的提高人源化小鼠抗肿瘤免疫力的手段。
图 4
为了确定YTHDF1诱导免疫抑制的分子机制，作者在有敲除或不敲除YTHDF1的CRC细胞中进行了RNA-seq和Ribo-seq。通过RNA-seq分析，MC38-NC和MC38-YTHDF1-KO细胞之间的差异表达基因在TNF和NF-κB信号通路中富集。在另一个CRC细胞系CT26中获得了一致的结果，表明YTHDF1调控TNF/NF-κB信号通路。
为了支持这些观点，qPCR验证了这一点 Ythdf1-KO降低了TNF/NF-κB靶点的mRNA表达。此外，Ribo-seq数据显示，YTHDF1的缺失与TNF信号通路的失活显著相关（图5A），YTHDF1基因敲除会降低与TNF信号传导相关基因的核糖体保护片段的丰度（图5A）。因此，YTHDF1可以通过促进蛋白翻译来调控TNF/NF-κB信号通路。
由于YTHDF1可以作为m6A阅读器，作者接下来进行了MeRIP-seq 来定位m6a修饰的转录本。通过筛选参与TNF信号通路的mRNA中的m6A峰，作者发现了p65 mRNA终止密码子附近的两个m6A位点（图5B），且通过MeRIP-qPCR进行了验证（图5C）。重要的是，作者通过RNA免疫共沉淀（RIP）测序和与抗YTHDF1抗体的RIP-qPCR确定了YTHDF1和p65 mRNA之间的直接相互作用（图5D），因此，p65 mRNA是YTHDF1的直接靶点。
作者发现，敲除Ythdf1基因均显著减弱了CT26和MC38细胞中p65蛋白的表达，特别是p65核的表达，而不影响NF-κB通路的其他调控因子，例如IKKα和IκBα的表达（图5E)。值得注意的是，在Ythdf1-KO细胞中，p65的mRNA表达没有变化，这支持了YTHDF1主要在蛋白翻译水平上调控p65，即在l中所报道的YTHDF1具有促进其靶标翻译的功能。在人结直肠癌细胞中获得了一致的结果，显示野生型YTHDF1的过表达，而不是功能失调的突变体，p65蛋白表达升高；相反，YTHDF1敲低降低了人CRC细胞中的p65蛋白（图5F）。使用抗YTHDF1抗体的RIP-qPCR也证实了YTHDF1和p65 mRNA之间的直接相互作用（图5G）。
接下来，作者试图在体内验证YTHDF1和p65在体内的关联。在Ythdf1基因敲除的小鼠中，p65和磷酸化的p65蛋白在结肠肿瘤中均增加（图5H）。综上所述，YTHDF1 pro 在体内和体外，通过刺激p65蛋白的表达来激活TNF和NF-κB信号通路。
图 5
为了了解ythdf1诱导的p65与其免疫抑制之间的联系，作者采用细胞因子多重免疫分析法在条件培养基中检测了23种不同的小鼠细胞因子 CRC细胞、肿瘤裂解液和来自携带同基因肿瘤的小鼠的血清。在这些细胞因子中，CXCL1在Ythdf1-KO组中持续减少（图6A），ELISA实验也证实了CXCL1的减少（图6B）。
据报道，CXCL1是NF-κB信号通路的转录靶点，它通过与其受体CXCR2.2的相互作用促进MDSC趋化，考虑到Ythdf1-KO减少了对MDSC的浸润，作者猜测YTHDF1可能调节了MDSC的迁移。因此，作者进行了体外MDSC迁移实验。
作者发现，来自野生型CRC细胞的条件培养基增强了MDSC的迁移，而敲除Ythdf1则削弱了MDSC的迁移（图6C）。通过CXCR2抑制剂SB265610阻断CXCL1-CXCR2的相互作用，消除了对照组和Ythdf1-KO培养上清液在介导MDSC迁移方面的差异（图6C）。因此，YTHDF1通过CXCL1/CXCR2轴促进MDSC的迁移。
作者接下来探究YTHDF1是否可以调控Cxcl1 mRNA的表达。与预期的一样，敲除Ythdf1显著抑制了Cxcl1 mRNA l 在小鼠（图6D）和人CRC细胞系中的水平。相反，野生型YTHDF1的过表达，提高了人CRC细胞中CXCL1的转录和蛋白水平，NF-κB激活剂，如TNF-α和IL-1β，已被报道可诱导CXCL1的表达。因此，作者用TNF-α处理MC38细胞，并测量CXCL1的mRNA和分泌情况。TNF-α刺激Cxcl1的mRNA和分泌，这种效应被Ythdf1的缺失所消除。
为了证实YTHDF1和CXCL1之间的联系，作者在TCGA CRC队列中检测了YTHDF1和CXCL1表达之间的关系。同样，ythdf1高的CRC显示出高的CXCL1 表达。除CXCL1外，CXCL2也与YTHDF1呈正相关。相反，CXCL5和CXCL8的表达与YTHDF1呈负相关。考虑到YTHDF1在促进MSDC浸润中的作用，接下来，作者对G-MDSCs的标记物CD33进行了CRC TMA检测。作者发现YTHDF1蛋白水平与瘤内CD33+细胞的比例呈正相关。因此，作者的发现支持YTHDF1-p65-CXCL1/ CXCR2 axi s在CRC中介导MDSC的迁移。
作者接下来研究了YTHDF1是否会影响MDSC的功能。从MC38同基因肿瘤中分离出CD11b+Gr-1+ MDSCs，并在体外与T细胞共培养（图6E）。从对照肿瘤中分离出来的MDSCs抑制了T细胞的增殖；然而，与对照组的MDSCs相比，来自Ythdf1-KO肿瘤的MDSCs对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞增殖的抑制活性显著降低(图 6F，G）。
为了支持这一观点，与Ythdf1-WT肿瘤相比，从Ythdf1-KO肿瘤中分离出的MDSCs的MDSC功能标志物Nos2、Arg1和Cd274的表达降低。流式细胞术证实iNOS+ MDSCs可减弱Ythdf1-KO肿瘤。这些数据验证了已报道的MDSCs对关键效应细胞的免疫抑制功能，包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，并支持表达ythdf1的CRC招募功能性MDSCs。
图 6
考虑到MDSCs浸润的减少已被报道与各种癌症类型的免疫治疗疗效的增强相关，作者试图测试靶向YTHDF1是否能增强结直肠癌的抗pd1治疗。与预期的一样，作者发现敲除Ythdf1，提高了抗pd1在MC38（MSI-H）同基因肿瘤中的疗效，延长了荷瘤小鼠的存活时间（图7A)。
作者进一步利用VNPs系统将特异性的Ythdf1-siRNA递送到肿瘤中。当MC38同基因肿瘤达到50~100mm3时，作者用VNP-siYthdf1（或VNP-siNC）和抗pd1治疗小鼠 治疗方法（或IgG)。与VNP-siNC相比，VNP-siYthdf1显著抑制了MC38肿瘤的生长（图7B、C）。值得注意的是，VNP-siYthdf1与抗pd1联合使用对肿瘤生长的抑制作用最强（图7B，C）。
基于同基因CT26（MSS CRC）肿瘤模型，作者进一步探讨了靶向YTHDF1是否能够克服MSS CRC中的抗pd1耐药性。因此，将敲除Ythdf1的CT26细胞注射到同基因小鼠中，并用抗pd1处理。作者发现，敲除Ythdf1显著提高了CT26同步基因的抗pd1治疗效果 neic肿瘤，否则对ICB治疗无反应（图7D，E）。
流式细胞术分析进一步显示，Ythdf1沉默和抗pd1联合使用显著增加了肿瘤浸润功能的CD8+ T细胞，在CT26和MC38同基因模型中，包括IFN-γ+ CD8+ T细胞和颗粒酶B+ CD8+ T细胞（图7F，G）。此外，联合治疗显著减少了MDSCs的积累，诱导CD4+ T细胞和CD8+ T细胞（图7G）。因此，靶向YTHDF1不仅增强了ICB对MSI-H结直肠癌的治疗效果，而且还通过抑制MDSCs的募集和改善功能，克服了MSS结直肠癌对ICB的耐药性 CD8+ T细胞。
图 7
本篇文献通过单细胞和m6A测序揭示了YTHDF1在结直肠癌的功能和机制，再一次表明了m6A调控因子可作为免疫治疗的重要的靶点。
联川生物
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